分光光度計(jì)原理
分光光度計(jì)是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器。分光光度計(jì)是電子引進(jìn)根據(jù)電磁輻射原理，不同的物質(zhì)具有不同的選擇吸收，也即具有不同的吸收光譜。分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。


許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無(wú)顏色的化合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。實(shí)踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通過(guò)比較溶液顏色深淺的方法來(lái)確定有色溶液的濃度，對(duì)溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析?；诒容^顏色深淺對(duì)溶液進(jìn)行定量分析的方法稱為比色分析法。 


分光光度法是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長(zhǎng)范圍為：
(1)200～400nm的紫外光區(qū)；
(2)400～760nm的可見(jiàn)光區(qū)；
(3)2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。


所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。


包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.
鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源.
氫燈（或氘燈）的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(zhǎng)的光譜可作為紫外光光度計(jì)的光源.
物質(zhì)的吸收光譜
如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜.
不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).
物質(zhì)的吸收光譜
當(dāng)光線通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí)透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收只有一部分光可透過(guò)溶液.
入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過(guò)光
如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失則:
入射光 = 吸收光 十 透過(guò)光


分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光線透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度；
I。為入射的單色光強(qiáng)度；
I 為透射的單色光強(qiáng)度；
T 為物質(zhì)的透射率；
k 為摩爾吸收系數(shù)；
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)
c 為物質(zhì)的濃度
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。


溶液為什么會(huì)有顏色，顏色又為什么與濃度有關(guān)呢？下面就討論這個(gè)問(wèn)題。
    一、光的互補(bǔ)及有色物質(zhì)的顯色原理
    1．光的波粒二象性
光是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。光在真空中以直線方式傳播，在不同的介質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL(zhǎng)、頻率、傳播速度等參量來(lái)描述，即光具有“波動(dòng)性”。光的顏色即由光的波長(zhǎng)決定，人眼能感覺(jué)到的光稱為可見(jiàn)光，其波長(zhǎng)在400～750nrn之間。在可見(jiàn)光之外是紅外光和紫外光。同時(shí)，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就是一個(gè)很好的例子。光的粒子性理論認(rèn)為，光是由“光子”（或稱“光量子”）所組成。在輻射能量時(shí)，光是以一份一份的能量E的形式輻射的，同時(shí)光被吸收時(shí)，能量也是一份一份被吸收的。這每一份能量的大小為hυ。光子的能量與波長(zhǎng)的關(guān)系為E=hυ= hc／λ，式中E為光子的能量（J：焦耳），υ為頻率，h為普朗克常數(shù)（6.63×10-34J?S），c為光速，λ為光的波長(zhǎng)。因此，不同波長(zhǎng)的光，其能量不同，短波能量大，長(zhǎng)波能量小。
    2。光的顯色原理
    若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖1中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。
各種溶液會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實(shí)驗(yàn)證明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補(bǔ)色。如一束白光通過(guò)高錳酸鉀溶液時(shí)，綠光大部分被選擇吸收，其它的光透過(guò)溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出，透過(guò)光中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。

二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律
溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用吸收定律來(lái)描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。原子吸收分光光度計(jì)也符合這個(gè)定律。
溶液對(duì)光的吸收   當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單色光照到溶液時(shí)，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光則透過(guò)溶液，如圖2所示

有：I0=Ia+ Ir+ It
I0--入射光強(qiáng)度
Ia--吸收光強(qiáng)度
Ir--反射光強(qiáng)度
It--透射光強(qiáng)度
通常由于Ir很小可忽略不計(jì)，上式可簡(jiǎn)化為 
I0=Ia+ It
透射光It與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度，用T表示：
T= It/ Ia
透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度，用A表示：
A=－lgT=lg1/T=lgIa/ It
吸光度越大，表示該物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。透光度和吸光度都是用來(lái)表示入射光被吸收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。
實(shí)驗(yàn)證明，單色光經(jīng)過(guò)有色溶液時(shí)，透過(guò)溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)，而且還與溶液的厚度以及溶液本身對(duì)光的吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為A＝KCL式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系數(shù)；C——溶液的濃度；L——光程，即溶液的厚度。


   消光系數(shù)K是一個(gè)常數(shù)。一種有色溶液對(duì)于一定波長(zhǎng)（單色光）的入射光的K值具有一定的數(shù)值。若溶液的濃度以摩爾／升表示，溶液厚度以厘米表示，則此時(shí)的K值稱為摩爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物的重要特性之一，根據(jù)這個(gè)數(shù)值的大小，可以估計(jì)顯色反應(yīng)的靈敏程度。
   從上式可以看出，當(dāng)K和L不變時(shí)，光密度E與溶液濃度C成正比關(guān)系，也可以說(shuō)，當(dāng)一束單色入射光經(jīng)過(guò)有色溶液且入射光、消光系數(shù)和溶液厚度不變時(shí)，吸光度A是隨著溶液濃度而變化的。


   這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比爾定律。光電比色計(jì)和分光光度計(jì)的比色分析方法就是根據(jù)這一定律來(lái)進(jìn)行的。但是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃度的有色溶液。
    三、朗伯-比爾定律的應(yīng)用
    1．等吸光度法
    從朗伯-比耳定律可知，當(dāng)用同一光源照射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時(shí)，若吸光度相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚度的乘積也相等。利用此關(guān)系在可見(jiàn)光區(qū)用眼作檢測(cè)器（目視比色法），即可求出待測(cè)溶液的濃度。


   2．計(jì)算法
    根據(jù)被測(cè)溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測(cè)溶液，使其成色后，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下用同一臺(tái)儀器分別測(cè)定它們的吸光度。
    在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As=KsCsLs
    在待測(cè)溶液中：Ax=KxCxLx
    如果測(cè)定時(shí)選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長(zhǎng)的單色光，保持溫度相同，則K也相等。將兩式相除可得As/ Ax=Cs/Cx
    由此可見(jiàn)，在滿足上述條件下，吸光度與溶液成正比。如果設(shè)計(jì)一種儀器，可以測(cè)量吸光度A值，則待測(cè)溶液的濃度即可求出 Cx=Ax/ As? Cs
    由于儀器的性能和實(shí)驗(yàn)環(huán)境在不斷的變化，所以在采用計(jì)算法時(shí)，必須每次都要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液和被測(cè)液進(jìn)行測(cè)量，然后利用上式進(jìn)行計(jì)算，否則會(huì)帶來(lái)較大的測(cè)量誤差。
    由于一般光電比色計(jì)在結(jié)構(gòu)上有不少偏離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準(zhǔn)確的結(jié)果，常采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。


  3．標(biāo)準(zhǔn)曲線法
    這種方法分以下幾步：
    （1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液。
    （2）測(cè)出每種溶液的吸光度A。
（3）做A～C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖3所示。
    有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)量。在同樣的條件下，用儀器測(cè)出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得被測(cè)溶液的濃度值Cx。

由于光電比色計(jì)工作在可見(jiàn)光區(qū)，只適合在有限個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)量，且波長(zhǎng)的半寬度大。因此，它不能滿足不同分析工作的需要。其次，光電比色計(jì)的靈敏度也低。為了克服以上不足，便發(fā)展了性能更好的分析方法：紫外--分光光度法。它利用單色器分光，其單色光純度高，波長(zhǎng)范圍寬，并可連續(xù)變化，解決了光電比色計(jì)存在的問(wèn)題。